محیط کشت PDA (پوتیتو دکستروز آگار) چیست؟

پلیتی را که چند روز پیش روی محیط کشت PDA کشت داده‌اید از انکوباتور بیرون می‌آورید و سطحش پر از کلنی‌های پنبه‌ای و رنگی است. اولین سؤال این است: این چه قارچی است و چرا این‌طور رشد کرده؟ بخش مهمی از جواب به محیطی برمی‌گردد که قارچ روی آن زندگی کرده است.

یک قارچ روی دو محیط مختلف می‌تواند دو ظاهر متفاوت داشته باشد. یکی سریع رشد می‌کند و اسپور نمی‌سازد، دیگری رنگ و اسپور می‌دهد. به همین دلیل آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی، مواد غذایی، گیاه‌پزشکی و آرایشی-بهداشتی سال‌هاست سراغ PDA می‌روند. ترکیبش ساده است، تهیه‌اش سخت نیست، و برای کشت بیشتر کپک‌ها و مخمرها جواب می‌دهد.

اما همین سادگی گاهی فریب دهنده است. اگر محیط اسیدی را بعد از افزودن اسید دوباره حرارت بدهید، آگار سفت نمی‌شود. اگر سیب زمینی را له کنید، محیط کدر می‌شود. و اگر نوع اشتباهی انتخاب کنید، باکتری‌ها جای قارچ را می‌گیرند.

در این مقاله قدم‌به‌قدم می‌بینید PDA چیست، از چه ساخته می‌شود، چطور از پودر آماده یا سیب زمینی تهیه می‌شود، کدام نوع آن برای چه نمونه‌ای مناسب است، کلنی‌ها روی آن چه شکلی‌اند و مشکلات رایج چطور حل می‌شوند. اگر تازه شروع کرده‌اید از ابتدا بخوانید. اگر وسط کار هستید، مستقیم به بخش روش تهیه محیط کشت PDA بروید.

محیط کشت PDA چیست؟

PDA مخفف Potato Dextrose Agar است، یعنی «سیب‌زمینی دکستروز آگار» که در فارسی «پوتیتو دکستروز آگار» هم نوشته می‌شود. این یک محیط کشت جامد و عمومی برای کشت، شمارش و نگهداری مخمرها و کپک‌هاست.

فکر پشت آن ساده است. عصاره سیب‌زمینی مواد مغذی پایه را تأمین می‌کند، دکستروز (گلوکز) انرژی سریع می‌دهد و آگار، که از جلبک دریایی به دست می‌آید، مخلوط را به یک ژل جامد تبدیل می‌کند. نتیجه یک سطح صاف است که اسپور قارچ روی آن می‌نشیند و کلنی می‌سازد.

وقتی می‌گوییم PDA «عمومی» است یعنی برای تشخیص یک گونه خاص طراحی نشده. تقریباً هر قارچی که آنجا قرار بگیرد رشد می‌کند. اگر بخواهید فقط قارچ رشد کند و باکتری‌ها حذف شوند، باید اسید یا آنتی‌بیوتیک اضافه کنید که در بخش انواع PDA توضیح داده‌ایم.

PDA برای چه کاری استفاده می‌شود؟

• مواد غذایی و لبنیات: کپک و مخمر نشانه‌های رایج فساد در آبمیوه، نوشیدنی، ماست و غذاهای آماده‌اند. PDA برای تشخیص و شمارش آن‌ها به کار می‌رود.
• نمونه‌های بالینی: برای کشت مخمرها و قارچ‌هایی که از نظر بالینی اهمیت دارند.
• لوازم آرایشی و دارویی: در کنترل آلودگی میکروبی محصولات، شمارش مخمر و کپک یکی از آزمون‌های رایج است.
• کشاورزی و گیاه‌پزشکی: برای جداسازی قارچ از بافت گیاه آلوده، مثلاً شناسایی Aspergillus niger از پیاز آلوده.
• نگهداری سویه‌ها: برای حفظ کشت ذخیره بعضی قارچ‌ها، از جمله درماتوفیت‌ها.

اساس کار PDA

سه جزء این محیط هرکدام نقش جدا دارند.

سیب زمینی چه می‌دهد؟

انفوزیون سیب‌زمینی پایه مغذی محیط است. نشاسته و ویتامین‌های آن به رشد پرپشت بیشتر قارچ‌ها کمک می‌کند.

دکستروز چه می‌کند؟

دکستروز منبع کربنی در دسترس است. قارچ آن را به‌راحتی مصرف می‌کند و رشد سریع‌تر می‌شود.

آگار چرا لازم است؟

آگار فقط سفت‌کننده است. قارچ از آن تغذیه نمی‌کند، اما بدون آن کلنی‌ها روی یک محیط مایع پخش می‌شوند و نمی‌شود آن‌ها را جدا کرد.

چرا اسپورزایی را تقویت می‌کند؟

نیتروژن در انفوزیون سیب‌زمینی نسبتاً کم است. بعضی قارچ‌ها در این شرایط انرژی را به جای رشد بیشتر، صرف ساخت اسپور می‌کنند. به همین دلیل قارچی که روی محیط غنی‌تر اسپور نمی‌دهد، روی PDA اغلب اسپور می‌سازد. رنگدانه‌سازی بعضی قارچ‌های پوستی هم روی آن بهتر دیده می‌شود.

ترکیبات محیط کشت PDA

مقادیر زیر برای یک لیتر آب مقطر است.

ماده	انفوزیون سیب‌زمینی	پودر تجاری
سیب‌زمینی	۲۰۰ گرم انفوزیون	۴ گرم عصاره
دکستروز	۲۰ گرم	۲۰ گرم
آگار	۱۵ تا ۲۰ گرم	۱۵ گرم
pH نهایی	حدود ۵٫۶	۵٫۶ (±۰٫۲)

پودر تجاری همه این مواد را آماده در خود دارد و مقدار مصرفش ۳۹ گرم در لیتر است. ۴ گرم عصاره سیب‌زمینی معادل ۲۰۰ گرم انفوزیون سیب‌زمینی است.

شاید ببینید بعضی منابع آگار را ۱۵ و بعضی ۲۰ گرم نوشته‌اند. برای پودر آماده همان مقدار برچسب سازنده مرجع است. در روش خانگی تفاوت کوچک است و بیشتر روی سفتی ژل اثر می‌گذارد.

روش تهیه PDA از پودر آماده

این ساده ترین و یکنواخت ترین روش است و برای کار روزمره آزمایشگاه توصیه می‌شود.

1. ۳۹ گرم پودر را در یک لیتر آب مقطر معلق کنید.
2. روی حرارت ملایم بجوشانید و هم بزنید تا کاملاً حل شود.
3. در اتوکلاو ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه استریل کنید.
4. بگذارید فشار اتوکلاو به صفر برسد، سپس درب را باز کنید و محیط را تا حدود ۴۵ تا ۵۰ درجه خنک کنید.
5. اگر pH حدود ۳٫۵ لازم دارید، در همین مرحله محلول استریل اسید (مثلاً حدود ۱۰ تا ۱۵ میلی‌لیتر تارتاریک اسید ۱۰٪ در هر لیتر) را اضافه کنید و آرام مخلوط کنید تا حباب نسازد. بعد از افزودن اسید، محیط را دوباره حرارت ندهید.
6. در پلیت استریل بریزید، ترجیحاً زیر هود لامینار، و بگذارید سفت شود.

اگر قرار است محیط اسیدی شود، اسید استریل را بعد از اتوکلاو و خنک شدن اضافه کنید. pH نهایی بعد از اتوکلاو را هم در صورت نیاز با pH متر بررسی کنید.

برای محصول مرک این مقدار بین ۵٫۴ و ۵٫۸ اعلام شده است.

روش تهیه خانگی (از سیب زمینی)

اگر پودر آماده ندارید یا برای کار آموزشی می‌خواهید خودتان بسازید:

1. ۲۰۰ گرم سیب‌زمینی شسته و خلال‌شده را در یک لیتر آب به مدت ۳۰ دقیقه بجوشانید.
2. عصاره را با یک پارچه صاف کنید تا زلال شود.
3. ۲۰ گرم دکستروز و ۱۵ تا ۲۰ گرم آگار اضافه کنید.
4. با آب به حجم یک لیتر برسانید و حرارت دهید تا آگار حل شود.
5. در اتوکلاو ۱۲۱ درجه، ۱۵ دقیقه استریل کنید و بعد در پلیت بریزید.

سیب‌زمینی را له نکنید!

هنگام صاف کردن، سیب زمینی پخته را فشار ندهید. اگر له شود، نشاسته زیادی وارد محلول می‌شود و محیط کدر یا ناپایدار می‌شود. فقط بگذارید عصاره آزادانه از پارچه عبور کند.

کیفیت سیب‌زمینی از یک نوبت به نوبت دیگر فرق می‌کند. اگر نتیجه یکنواخت و قابل تکرار می‌خواهید، پودر آماده انتخاب بهتری است.

کشت نمونه و مشاهده نتایج

برای کشت نمونه با استفاده از لوپ استریل شده از ماده مورد نظر برداشته و روی محیط کشت می دهیم.

سپس محیط کشت داده شده را در دمای 30-25 درجه سانتی گراد به طور معکوس(جهت افزایش رطوبت آگار به سمت بالا باشد) انکوبه می نماییم.

برای مشاهده رشد قارچ ها حداقل یک هفته و برای رد کردن جواب منفی 4 تا 6 هفته نیاز است.

کلنی های سفید خامه ای شکل نشان دهنده وجود مخمر، و کلنی های رشته ای رنگی نشان دهنده وجود قارچ در نمونه مورد نظر است.

انواع PDA و افزودنی‌ها

PDA ساده محیطی عمومی است و بعضی باکتری‌های اسیدی هم روی آن رشد می‌کنند. وقتی نمونه آلوده است یا باید فقط قارچ شمرده شود، یکی از افزودنی‌های زیر را استفاده کنید.

نوع	افزودنی	کاربرد
PDA ساده	بدون افزودنی	کشت عمومی از نمونه‌های تمیز
PDA با تارتاریک اسید	تارتاریک اسید ۱۰٪ استریل، رسیدن به pH حدود ۳٫۵	بررسی میکروبی مواد غذایی و لبنیات
PDA با لاکتیک اسید	لاکتیک اسید ۱۰٪ استریل، حدود ۱ میلی‌لیتر در لیتر	مهار باکتری در نمونه‌های غذایی
PDA با کلرامفنیکل	آنتی‌بیوتیک کلرامفنیکل	جداسازی انتخابی قارچ از نمونه‌های مخلوط
PDA با کلرتتراسایکلین	آنتی‌بیوتیک کلرتتراسایکلین	شمارش مخمر و کپک در لوازم آرایشی

افزودن اسید، pH را به حدود ۳٫۵ می‌رساند و باکتری‌ها دیگر رشد نمی‌کنند. آنتی‌بیوتیک‌ها هم باکتری‌ها را مهار می‌کنند، بدون اینکه محیط خیلی اسیدی شود. مقدار دقیق هر افزودنی را از استاندارد روش یا دستورالعمل سازنده بخوانید. محیط اسیدی‌شده را دوباره گرم نکنید، چون آگار هیدرولیز می‌شود و ژل نمی‌بندد.

کشت نمونه و شرایط نگهداری

نحوه کشت

با لوپ استریل یا سواب، نمونه را روی سطح محیط بکشید یا پخش کنید. پلیت را برچسب بزنید و برای جلوگیری از چکیدن میعانات روی کلنی، وارونه (درب پایین) در انکوباتور بگذارید.

دما و زمان

دمای رایج ۲۵ تا ۳۰ درجه سانتی‌گراد است. زمان رشد به گونه بستگی دارد و از چند روز تا حدود یک هفته متغیر است. برای کنترل کیفیت محصول 110130، مرک انکوباسیون ۵ روزه در ۲۸ درجه را گزارش می‌کند.

مثال از سویه‌های PTCC

مرکز کلکسیون PTCC ایران برای این سویه‌ها، PDA را محیط کشت و این دماها را ثبت کرده است:

• Penicillium chrysogenum (PTCC 5035): ۲۴ درجه
• Aspergillus niger (PTCC 5013): ۲۵ درجه
• Trichoderma sp. (PTCC 5238): ۲۶ درجه
• Rhizomucor miehei (PTCC 5240): ۳۷ درجه

بعضی قارچ‌ها، مثل Aspergillus fumigatus، در گروه خطر ۲ قرار دارند. پلیت‌های ناشناخته را فقط در کابین ایمنی باز کنید و درب آن‌ها را با پارافیلم ببندید.

ویژگی کلنی قارچ‌ها روی PDA

رنگ و ظاهر دقیق به سویه، سن کشت و دما بستگی دارد. این‌ها توصیف‌های رایج‌اند:

• Aspergillus niger: ابتدا سفید، بعد با اسپورهای سیاه. بافت پودری تا مخملی.
• Penicillium: سبز مایل به آبی، مخملی، با حاشیه سفید.
• Trichoderma: سریع‌رشد، ابتدا سفید و بعد لکه‌های سبز تیره.
• Trichophyton rubrum: سفید تا کرم و پنبه‌ای، با پشت قرمز تا زرشکی. ماکروکنیدی‌های مدادی‌شکل آن روی PDA به‌خوبی دیده می‌شود.

تفاوت PDA با SDA و MEA

سه محیط رایج قارچی را می‌توان این‌طور مقایسه کرد:

	PDA	SDA	MEA
پایه مغذی	انفوزیون سیب‌زمینی	پپتون	عصاره مالت
دکستروز	حدود ۲٪	۲ تا ۴٪	ندارد یا کم
pH تقریبی	۵٫۶	۵٫۶	حدود ۵
نقطه قوت	اسپورزایی و رنگدانه	رشد مخمرها و قارچ‌های پوستی	کشت عمومی قارچ‌ها

اگر هدفتان بررسی اسپورزایی و ظاهر کلنی است، PDA انتخاب خوبی است. برای مخمرها و قارچ‌های پوستی، SDA را هم در نظر بگیرید. MEA برای کار عمومی با قارچ‌ها، به‌خصوص وقتی به محیط ساده‌تری نیاز دارید، کاربرد دارد.

محدودیت‌های PDA

PDA همه‌کاره نیست و شناسایی نهایی را به عهده ندارد.

• یک محیط عمومی است، نه افتراقی. فقط شناسایی اولیه از روی ظاهر کلنی ممکن است و تأیید نهایی به میکروسکوپ یا روش مولکولی نیاز دارد.
• باکتری‌های اسیدی هم روی آن رشد می‌کنند.
• در نمونه‌های آلوده، بدون اسید یا آنتی‌بیوتیک نتیجه قابل اتکا نیست.

مشکلات رایج و راه‌ حل در مورد PDA

محیط سفت نمی‌شود

معمولاً محیط اسیدی دوباره حرارت دیده است. اسید را بعد از اتوکلاو و خنک شدن اضافه کنید و دوباره گرم نکنید.

محیط کدر است

در روش خانگی نشاسته زیادی وارد شده است. سیب‌زمینی را هنگام صاف کردن له نکنید.

باکتری رشد کرده است

PDA ساده انتخابی نیست. از نوع اسیدی یا آنتی‌بیوتیک‌دار استفاده کنید.

اسپورزایی ضعیف است

اگر قارچ روی محیط غنی‌تر اسپور نمی‌دهد، کشت را به PDA منتقل کنید و چند روز زمان بدهید.

آگار خشک شده است

پلیت زیاد نگه داشته شده یا باز مانده است. پلیت‌ها را در کیسه دربسته نگه دارید.

نگهداری پودر و پلیت آماده

پودر را در ظرف دربسته و در دمای ۱۵ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد نگه دارید. برای محصول مرک 110130 همین دما اعلام شده است.

پلیت‌های آماده را وارونه و در کیسه دربسته در یخچال بگذارید و تاریخ ساخت را روی آن بنویسید. قبل از استفاده، سطح پلیت را از نظر خشکی و آلودگی نگاه کنید.

خرید PDA مرک

PDA مرک با کد 110130 (رده GranuCult prime، گرانول، مخصوص میکروبیولوژی) برای قارچ‌ها و مخمرها عرضه می‌شود. مقدار مصرف ۳۹ گرم در لیتر و pH نهایی ۵٫۶ است.

مرک برای کنترل کیفیت این محصول، رشد این سویه‌ها را آزمایش کرده است:

• Geotrichum candidum: رشد خوب تا خیلی خوب
• Penicillium commune: رشد متوسط تا خوب
• Trichophyton ajelloi: رشد متوسط تا خوب

محیط آماده‌شده شفاف تا کمی کدر و به رنگ زرد-قهوه‌ای است. برای شماره بچ، گواهی آنالیز و بسته‌بندی موجود می‌توانید با شیمی بان تماس بگیرید.

جمع بندی کلی از محیط کشت PDA

محیط کشت PDA یک محیط ساده برای کشت مخمر و کپک است که ترکیب و روش تهیه‌اش مشخص است و اگر نکات مهم (اسید بعد از اتوکلاو، نشاسته و دمای انکوباسیون) رعایت شود، نتیجه قابل اتکایی می‌دهد. برای کار روزمره پودر آماده را انتخاب کنید و برای نمونه‌های آلوده نوع اسیدی یا آنتی‌بیوتیک‌دار را در نظر بگیرید.

سوالات متداول مرتبط با محیط کشت PDA

پلیت‌ها را در چه دمایی و چند روز انکوبه کنیم؟

معمولاً ۲۵ تا ۳۰ درجه و چند روز تا یک هفته، بسته به نوع قارچ.

چرا پلیت را وارونه انکوبه می‌کنند؟

تا قطره‌های آب روی سطح کلنی نچکند و کلنی‌ها به هم نچسبند.

PDA برای چه میکروارگانیسم‌هایی استفاده می‌شود؟

برای مخمرها و کپک‌ها.

PDA انتخابی است؟

خودش نه. با افزودن اسید یا آنتی‌بیوتیک (مثل کلرامفنیکل) برای قارچ انتخابی می‌شود.

PDA را در چه دمایی اتوکلاو کنیم؟

۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه.

چرا PDA من سفت نمی‌شود؟

معمولاً محیط اسیدی دوباره حرارت دیده است. اسید را بعد از اتوکلاو و خنک شدن اضافه کنید و دوباره گرم نکنید.

با PDA می‌شود قارچ را قطعی شناسایی کرد؟

نه. فقط شناسایی اولیه از روی ظاهر کلنی ممکن است. برای تأیید نهایی میکروسکوپ یا روش مولکولی لازم است.