اگر شرایط مناسب باشد، یک باکتری اشرشیاکلی تقریباً هر ۲۰ دقیقه دو برابر می‌شود و بعد از حدود هفت ساعت به بیش از دو میلیون سلول می‌رسد. اما همین باکتری روی یک سطح خشک یا بدون غذا حتی یک کلنی هم نمی‌سازد. فرق این دو حالت در چیزی است که به آن محیط کشت می‌گوییم.
محیط کشت تعیین می‌کند چه میکروبی رشد کند، چه شکلی بگیرد و حتی چه ویژگی‌ای از خودش نشان بدهد. یک باکتری روی یک محیط صورتی می‌شود و روی محیط دیگر بی‌رنگ. یک قارچ در یکی فقط رشد می‌کند و در دیگری اسپور هم می‌سازد. انتخاب اشتباه یعنی هفته‌ها وقت و نتیجه‌ای که قابل اتکا نیست.
برای همین، شناخت انواع محیط کشت اولین قدم هر کار آزمایشگاهی است. اگر دنبال یک محیط مشخص هستید، مستقیم به جدول نمونه‌های پرکاربرد بروید. اگر تازه شروع کرده‌اید، از همین جا بخوانید و برای خرید محیط کشت به صفحات دیگر سر بزنید.
0 تا 100 محیط کشت!
محیط کشت چیست؟
محیط کشت یا Growth Medium ماده‌ای مایع، ژل مانند یا جامد است که مواد مغذی و شرایط لازم برای رشد و تکثیر جانداران ریز را فراهم می‌کند. معمولاً پیش از استفاده استریل می‌شود، یعنی از همه میکروب‌ها پاک می‌شود، تا فقط جانداری که ما وارد می‌کنیم در آن رشد کند.
بعضی محیط‌ها از مواد پیچیده ساخته می‌شوند، مثل عصاره گوشت، پپتون و عصاره مخمر. بعضی دیگر از مقدار دقیق چند نمک و یک ترکیب آلی ساخته می‌شوند. اگر آگار به مایع اضافه شود، محیط جامد می‌شود و می‌توان روی آن کلنی‌های جدا ساخت.
محیط کشت میکروبی
برای باکتری‌ها، مخمرها، کپک‌ها، جلبک‌ها و تک‌یاخته‌ها استفاده می‌شود. بیشتر مطالب این مقاله درباره همین گروه است.
محیط کشت سلولی
برای رشد سلول‌های پستانداران و حیوانات در آزمایشگاه به کار می‌رود، مثل DMEM و RPMI 1640. بعداً جدا توضیح می‌دهیم.
محیط کشت گیاهی
برای کشت بافت و سلول گیاهی استفاده می‌شود و معمولاً هورمون و ساکارز هم دارد.
اجزای اصلی محیط کشت
هر محیط کشتی چند جزء پایه دارد. نسبت و نوع این اجزا تعیین می‌کند محیط برای چه چیزی مناسب است.
| جزء | نقش | مثال |
|---|---|---|
| منبع کربن و انرژی | غذای اصلی میکروب | گلوکز، لاکتوز، ساکارز |
| منبع نیتروژن و آمینواسید | ساخت پروتئین | پپتون، عصاره مخمر، عصاره گوشت |
| آب | حلال و محیط واکنش‌ها | آب مقطر |
| نمک‌ها و مواد معدنی | تنظیم فشار اسمزی و کوفاکتور آنزیم‌ها | کلرید سدیم، فسفات‌ها |
| ویتامین و فاکتور رشد | ضروری برای میکروب‌های سخت‌رشد | عصاره مخمر، خون |
| بافر | ثابت نگه داشتن pH | فسفات، بی‌کربنات |
| ماده سفت‌کننده | تبدیل مایع به ژل | آگار |
| شناساگر یا بازدارنده | تمایز یا مهار میکروب‌ها | نوترال رد، کریستال ویولت، نمک صفراوی |
آگار چیست و چرا استفاده می‌شود؟
آگار پلی‌ساکاریدی است که از جلبک دریایی به دست می‌آید. حدود ۸۵ درجه سانتی‌گراد ذوب می‌شود و بین ۳۲ تا ۴۰ درجه ژل می‌بندد. به همین دلیل می‌توان آن را داغ استریل کرد، کمی خنک کرد و در پلیت ریخت. بیشتر میکروب‌ها آگار را مصرف نمی‌کنند، پس ژل در طول کشت سالم می‌ماند. معمولاً حدود ۱٫۵ درصد آگار برای محیط جامد و مقدار کمتر برای محیط نیمه‌جامد استفاده می‌شود.
برای خرید آنلاین کشت آگار با قیمت مناسب و به روز حتما با ما در تماس باشید!
دسته بندی محیط های کشت
محیط‌های کشت را از سه نگاه می‌توان دسته‌بندی کرد: حالت فیزیکی، ترکیب شیمیایی و کاربرد.
بر اساس حالت فیزیکی
| نوع | ویژگی | کاربرد |
|---|---|---|
| مایع (براث) | بدون آگار | افزایش تعداد میکروب، تولید زیست‌توده، آزمون‌های بیوشیمیایی |
| جامد | حدود ۱٫۵٪ آگار | جداسازی کلنی، کشت خالص، مطالعه ظاهر کلنی |
| نیمه‌جامد | مقدار کم آگار | بررسی تحرک، بعضی کشت‌های بی‌هوازی |
بر اساس ترکیب شیمیایی
| نوع | ترکیب | مثال |
|---|---|---|
| شیمیایی تعریف‌شده (Defined) | همه اجزا و مقدارشان مشخص است | محیط حداقل M9 با گلوکز |
| پیچیده (Complex) | عصاره‌ها و هضم‌شده‌ها، ترکیب دقیق نامشخص | نوترینت براث، TSB، BHI |
محیط‌های پیچیده رایج‌ترین گروه‌اند، چون ارزان‌اند و برای بیشتر میکروب‌های هتروتروف جواب می‌دهند. محیط تعریف‌شده را وقتی می‌خواهید دقیقاً بدانید میکروب چه مصرف می‌کند یا در آزمون‌های سنجش استفاده می‌شود.
بر اساس کاربرد
این مهم‌ترین دسته‌بندی در آزمایشگاه است و در بخش بعد جداگانه می‌آید.
انواع محیط کشت بر اساس کاربرد
| نوع | هدف | مثال |
|---|---|---|
| پایه یا عمومی | رشد طیف وسیعی از میکروب‌ها | نوترینت آگار، نوترینت براث |
| غنی‌شده (Enriched) | رشد میکروب‌های سخت‌رشد | بلاد آگار، چاکلت آگار |
| انتخابی (Selective) | مهار میکروب‌های ناخواسته | MacConkey، PDA با کلرامفنیکل |
| افتراقی (Differential) | تشخیص میکروب‌ها از روی رنگ یا تغییر محیط | بلاد آگار، TSI، SIM |
| غنی‌ساز (Enrichment) | زیاد کردن تعداد میکروب هدف | سلنیت براث |
| ترابری (Transport) | حفظ زنده‌ماندن در مسیر انتقال، بدون رشد | Stuart، Amies، Cary-Blair |
| کاهنده (Reducing) | کشت بی‌هوازی‌ها | براث تیوگلیکولات |
| سنجش (Assay) | تعیین مقدار ویتامین یا آنتی‌بیوتیک | محیط‌های ویژه آزمون |
تفاوت محیط انتخابی و افتراقی
محیط انتخابی بعضی میکروب‌ها را مهار می‌کند و به بقیه اجازه رشد می‌دهد. محیط افتراقی همه یا بیشتر آن‌ها را رشد می‌دهد، اما از روی رنگ یا تغییر محیط نشان می‌دهد چه کسی چه کاری می‌کند. بسیاری از محیط‌ها هر دو کار را می‌کنند.
تفاوت محیط انتخابی و غنی‌ساز
هر دو رشد میکروب هدف را بیشتر می‌کنند، اما محیط غنی‌ساز بیشتر برای مایع و افزایش تعداد میکروب‌ها تا حد قابل تشخیص است. محیط انتخابی هم رشد را مهار می‌کند و هم معمولاً جامد است تا کلنی جدا شود.
چرا بعضی محیط‌ها هم انتخابی و هم افتراقی‌اند؟
MacConkey نمک صفراوی و کریستال ویولت دارد که باکتری‌های گرم مثبت را مهار می‌کنند. لاکتوز و شناساگر نوترال رد هم دارد، پس تخمیرکننده‌های لاکتوز صورتی می‌شوند و بقیه بی‌رنگ می‌مانند. EMB هم با ائوزین Y و متیلن بلو همین دو کار را می‌کند و اشرشیاکلی معمولاً کلنی تیره با جلای سبز فلزی می‌دهد.
محیط کشت قارچ
قارچ‌ها pH اسیدی‌تر و غذای ساده‌تری می‌خواهند. دو محیط رایج PDA (سیب‌زمینی دکستروز آگار) و SDA (سابورو دکستروز آگار) هستند. PDA اسپورزایی را تقویت می‌کند و SDA برای مخمرها و قارچ‌های پوستی رایج است. برای آموزش کامل محیط PDA، [مقاله محیط کشت PDA] را ببینید.
نمونه‌های پرکاربرد
| محیط | نوع | کاربرد |
|---|---|---|
| نوترینت آگار | پایه | کشت عمومی باکتری‌ها |
| بلاد آگار | غنی‌شده و افتراقی | رشد باکتری‌های سخت‌رشد و تشخیص همولیز |
| چاکلت آگار | غنی‌شده | میکروب‌های سخت‌رشد مثل Neisseria و Haemophilus |
| MacConkey | انتخابی و افتراقی | جداسازی باکتری‌های گرم منفی روده‌ای |
| EMB | انتخابی و افتراقی | جداسازی و تشخیص باکتری‌های روده‌ای مثل E. coli |
| TSI | افتراقی | تخمیر گلوکز، لاکتوز و ساکارز، تولید گاز و سولفید هیدروژن |
| SIM | افتراقی (نیمه‌جامد) | تولید سولفید هیدروژن، ایندول و تحرک |
| Mueller-Hinton | پایه | آزمون حساسیت آنتی‌بیوتیکی |
| براث تیوگلیکولات | کاهنده | کشت بی‌هوازی‌ها و میکروب‌های کم‌اکسیژن‌دوست |
| PDA و SDA | قارچی | کشت و شمارش مخمر و کپک |
TSI حاوی سه قند، پپتون، سولفات آهن و فنل‌رد است. تحرک را TSI نشان نمی‌دهد و برای آن باید از SIM استفاده کرد. در SIM برای دیدن ایندول معرف کواکس هم لازم است.
محیط کشت سلولی و گیاهی
محیط کشت سلولی
سلول‌های پستانداران به محیط‌هایی مثل DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) و RPMI 1640 نیاز دارند. این محیط‌ها آمینواسید، ویتامین، مواد معدنی، نمک و گلوکز دارند و معمولاً با حدود ۱۰ درصد سرم جنین گاوی (FBS) و آنتی‌بیوتیک‌هایی مثل پنی‌سیلین و استرپتومایسین تکمیل می‌شوند. pH حدود ۷٫۴ است و سلول‌ها در انکوباتور ۳۷ درجه با ۵٪ دی‌اکسید کربن نگهداری می‌شوند.
محیط کشت گیاهی
در کشت بافت گیاهی، رایج‌ترین محیط Murashige and Skoog (MS) است. این محیط نمک‌های معدنی، ویتامین، ساکارز و هورمون‌های گیاهی (اکسین و سیتوکینین) دارد و معمولاً با آگار سفت می‌شود.
روش کلی تهیه محیط کشت
دستور دقیق هر محیط روی برچسب سازنده آمده، اما مراحل کلی این‌هاست:
- مقدار پودر را طبق برچسب وزن کنید (مثلاً PDA مرک ۳۹ گرم در لیتر).
- در آب مقطر معلق کنید و با گرما حل کنید.
- در صورت نیاز pH را تنظیم کنید.
- در اتوکلاو ۱۲۱ درجه به مدت ۱۵ دقیقه استریل کنید (بیشتر محیط‌ها).
- تا حدود ۴۵ تا ۵۰ درجه خنک کنید.
- افزودنی‌های حساس به گرما، مثل خون، سرم، آنتی‌بیوتیک و بعضی اسیدها را بعد از خنک شدن اضافه کنید.
- در پلیت یا لوله بریزید و بگذارید سفت شود.
نکات استریل کردن
- محیط‌های حاوی آگار را مایع اتوکلاو کنید، نه جامد.
- بعد از اضافه کردن اسید یا افزودنی حساس، دوباره حرارت ندهید.
- براث تیوگلیکولات را بعد از پخش در لوله یک بار اتوکلاو کنید. دوباره گرما دادن لازم نیست.
کنترل کیفیت و نگهداری محیط کشت
- pH: بعد از اتوکلاو pH را بررسی کنید. برای محصول PDA مرک این مقدار ۵٫۴ تا ۵٫۸ است.
- استریل بودن: چند پلیت از هر بچ را بدون نمونه انکوبه کنید. رشد یعنی محیط آلوده است.
- تست رشد: با سویه مرجع بررسی کنید که محیط واقعاً رشد را پشتیبانی می‌کند.
- نگهداری پودر: در ظرف دربسته و در دمای اعلام‌شده روی برچسب (مثلاً ۱۵ تا ۲۵ درجه برای PDA مرک).
- نگهداری پلیت: وارونه و در کیسه دربسته در یخچال، با تاریخ ساخت روی آن.
محیط کشت آماده یا ساخت دستی؟
ساخت محیط از اجزای جداگانه ممکن است، اما دقت زیادی می‌خواهد. بیشتر آزمایشگاه‌ها پودر آماده یا محیط از پیش ساخته را انتخاب می‌کنند:
- ثبات نتیجه: هر بچ تحت کنترل کیفی ساخته می‌شود و نتایج تکرارپذیرتر است.
- صرفه‌جویی در زمان: وزن کردن اجزا، تنظیم pH و آماده‌سازی لازم نیست.
- کاهش خطا: احتمال اشتباه در مقدار و استریلیزاسیون کمتر می‌شود.
- دسترسی به محیط تخصصی: بعضی محیط‌ها، مثل محیط‌های بی‌هوازی یا انتخابی ویژه، ساخت دستی دشواری دارند.
مشکلات رایج و راه‌حل
| مشکل | علت احتمالی | راه‌حل |
|---|---|---|
| آلودگی در پلیت | استریلیزاسیون ناقص یا ریختن در شرایط غیراستریل | زمان و دمای اتوکلاو را بررسی و پلیت را زیر هود بریزید |
| محیط سفت نمی‌شود | آگار کم، گرم کردن دوباره محیط اسیدی | مقدار پودر و ترتیب افزودن اسید را بررسی کنید |
| میکروب رشد نمی‌کند | pH یا محیط نامناسب | نوع محیط و pH را با نیاز میکروب تطبیق دهید |
| رنگ محیط نامعمول است | افزودنی یا pH اشتباه | تاریخ انقضا و مقدار شناساگر را چک کنید |
| آگار خشک شده | نگهداری طولانی یا باز ماندن پلیت | پلیت را در کیسه دربسته نگه دارید |
راهنمای انتخاب و خرید محیط کشت
قبل از خرید این‌ها را مشخص کنید:
- نوع میکروب: باکتری، قارچ، سلول یا گیاه
- هدف: کشت عمومی، جداسازی، شناسایی یا شمارش
- گرید و برند: میکروبیولوژی، دارویی یا آموزشی
- شماره بچ و تاریخ انقضا: روی بسته باید مشخص باشد
- گواهی آنالیز (CoA) و SDS: در صورت نیاز درخواست کنید
- شرایط نگهداری: دما و رطوبت اعلام‌شده
برای استعلام قیمت و موجودی محیط‌های کشت مرک و دیگر برندها می‌توانید از طریق واتس‌اپ با فروشگاه آنلاین مواد شیمیایی شیمی بان در ارتباط باشید.
جمع بندی نهایی محیط کشت!
محیط کشت قلب هر کار میکروبیولوژی است. با شناخت اجزای آن (منبع کربن، نیتروژن، نمک، آگار) و دسته‌بندی‌هایش (فیزیکی، شیمیایی و کاربردی) می‌توانید دقیقاً همان محیطی را انتخاب کنید که با نمونه و هدف شما می‌خواند. برای قارچ‌ها از PDA و SDA شروع کنید و برای باکتری‌های روده‌ای از MacConkey و EMB. رعایت استریل، pH و نگهداری درست هم نتیجه را قابل اتکا می‌کند.
سوالات مرتبط مرتبط با محیط کشت
محیط کشت را در چه دمایی استریل کنیم؟
برای بیشتر محیط‌ها ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه. بعضی محیط‌های حاوی قند یا ترکیبات حساس دمای پایین‌تری می‌خواهند.
فرق محیط کشت جامد و مایع چیست؟
جامد آگار دارد و برای جداسازی کلنی است. مایع آگار ندارد و برای افزایش تعداد میکروب‌هاست.
آگار خون چه تفاوتی با نوترینت آگار دارد؟
نوترینت آگار پایه است. آگار خون با خون غنی شده و رشد میکروب‌های سخت‌رشد را پشتیبانی می‌کند و همولیز را نشان می‌دهد.
محیط کشت انتخابی است یا افتراقی؟
بعضی فقط یکی‌اند و بعضی مثل MacConkey و EMB هر دو.
چرا pH محیط قارچی کمتر از محیط باکتری است؟
قارچ‌ها در محیط اسیدی بهتر رشد می‌کنند و اسیدی بودن باکتری‌ها را مهار می‌کند. مثلاً pH محیط PDA حدود ۵٫۶ است.
پلیت آماده را چقدر می‌توان نگه داشت؟
طبق دستور سازنده. پلیت باید وارونه و در کیسه دربسته در یخچال بماند و قبل از استفاده از نظر خشکی و آلودگی بررسی شود.
